การเปรียบเทียบประสิทธิภาพในการผลิตไบโอดีเซลจากน้ำมันปาล์มโดยปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่น ระหว่างเซลล์ตรึงแบคทีเรียและเอนไซม์ไลเปสตรึงรูปที่ทนต่อตัวทำละลายอินทรีย์

ไบโอดีเซล หรือเมทิลเอสเทอร์ของกรดไขมัน เป็นแหล่งพลังงานทางเลือกที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมและได้รับความสนใจเพิ่มมากขึ้นในปัจจุบัน จากกระบวนการผลิตไบโอดีเซลที่ได้มีการพัฒนาเรื่อยมาพบว่า การใช้เอนไซม์ไลเปสเร่งปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่น เป็นกระบวนการที่ได้รับความสนใจเพิ่มมากขึ้น แต่การใช้เอนไซม์เร่งปฏิกิริยาก็มีข้อจำกัดในเรื่องของราคาและความเสถียรที่ต่ำของเอนไซม์ เมื่ออยู่ในสภาวะที่มีตัวทำละลายอินทรีย์ เช่น เมทานอล เป็นองค์ประกอบ จากปัญหาดังกล่าวทำให้เกิดการค้นหาแหล่งผลิตเอนไซม์ไลเปสจากธรรมชาติที่ให้เอนไซม์ไลเปสที่มีความเสถียรสูงและทนต่อสภาวะที่มีตัวทำละลายอินทรีย์เพิ่มมากขึ้น จากแบคทีเรียจำนวน 22 ไอโซเลทที่สามารถผลิตเอนไซม์ไลเปสได้ พบแบคทีเรีย 2 ไอโซเลทที่สามารถผลิตเอนไซม์ไลเปสได้ในปริมาณสูงและถูกเลือกมาใช้เป็นแหล่งผลิตเอนไซม์ไลเปสเพื่อศึกษาต่อไป

แบคทีเรียไอโซเลทที่ 1 ซึ่งได้มีการจัดจำแนกสายพันธุ์เป็น Acinetobacter baylyi สามารถผลิตเอนไซม์ไลเปสออกภายนอกเซลล์ จากการศึกษาปัจจัยทางกายภาพที่ส่งผลต่อการผลิตเอนไซม์พบว่า A. baylyi สามารถผลิตเอนไซม์ได้สูงที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ค่าพีเอช 5.75 ด้วยการเขย่าด้วยความเร็ว 150 รอบต่อนาที โดยสามารถผลิตเอนไซม์ไลเปสได้แอคติวิตีและปริมาณมวลชีวภาพสูงที่สุด เมื่อเลี้ยงเชื้อเจริญในสภาวะดังกล่าวเป็นเวลา 15 ชั่วโมง โดยพบว่าการเติมกลูโคสความเข้มข้นร้อยละ 0.8 (น้ำหนักต่อปริมาตร) หรือแอมโมเนียซัลเฟตความเข้มข้นร้อยละ 0.4 (น้ำหนักต่อปริมาตร) ลงในอาหารเลี้ยงสามารถเพิ่มปริมาณการผลิตเอนไซม์ไลเปสได้ 2.5 เท่า แต่หากเติมพร้อมกันจะเพิ่มแอคติวิตีของ เอนไซม์ไลเปสได้ 24 เท่า ขณะที่การเติมทริปโตน ความเข้มข้นร้อยละ 0.8 (น้ำหนักต่อปริมาตร) ลงในอาหารเลี้ยงสามารถเพิ่มแอคติวิตีของเอนไซม์ได้ประมาณ 8.5 เท่า เมื่อเลี้ยงเชื้อในอาหารดังกล่าวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง สำหรับการเติมกรดอะมิโนอะลานีน ความเข้มข้น 5 มิลลิโมลาร์ หรือการเติมอะการ์ ความเข้มข้นร้อยละ 0.1 (น้ำหนักต่อปริมาตร) ลงในอาหารเลี้ยงจะให้แอคติวิตีของเอนไซม์ไลเปสสูงขึ้นประมาณ 7 เท่า เมื่อเทียบกับค่าแอคติวิตีที่ได้จากการเลี้ยงในอาหารที่ไม่มีการเติมสารอาหารเสริมแต่การเติมเฮกซาเดคเคนลงในอาหารเลี้ยงไม่ส่งผลต่อการผลิตเอนไซม์ไลเปสของ A. baylyi และที่น่าสนใจคือ การเติมทวีน 80 ความเข้มข้นร้อยละ 0.8 (น้ำหนักต่อปริมาตร) ลงในอาหารเลี้ยงนั้นสามารถเพิ่มการผลิตเอนไซม์ไลเปสของ A. baylyi ได้สูงที่สุดคือ 16,142 เท่า เมื่อทำบริสุทธิ์เอนไซม์ไลเปสจาก A. baylyi ด้วยการตกตะกอนเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตความเข้มข้นอิ่มตัวร้อยละ 60-70 และการทำโครมาโทกราฟีแบบคัดกรองขนาดพบเอนไซม์ไลเปสมีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 21.89 เท่า ซึ่งมีมวลโมเลกุลสัมพัทธ์เท่ากับ 30 กิโลดาลตัน เอนไซม์บริสุทธิ์แสดงค่าแอคติวิตีต่อสับสเตรทพาราไนโตรฟีนิลปาล์มมิเตท (pNPP) สูงที่สุดที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียสและค่าพีเอชเท่ากับ 8.0 และมีความเสถียรในช่วงค่าพีเอชระหว่าง 6.0 และ 9.0 และที่อุณหภูมิ 60-80 องศาเซลเซียส เมื่อศึกษาความเสถียรของเอนไซม์ในสภาวะที่มีตัวทำละลายอินทรีย์ชนิดต่างๆที่ความเข้มข้นร้อยละ 50 (ปริมาตรต่อปริมาตร) พบว่าเอนไซม์ไลเปสของ A. baylyi ยังสามารถรักษาความเสถียรอยู่ได้ในตัวทำละลายอินทรีย์หลายชนิด โดยเฉพาะเบนซีนและไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ล แต่แอคติวิตีจะมีค่าลดลงประมาณร้อยละ 40 เมื่ออยู่ในสภาวะที่มีเดคเคน เฮกเซน อะซิโตไนไตร์ล และแอกอฮอล์ลสายสั้น และเอนไซม์ยังคงมีความเสถียรในแอลกอฮอล์ลสายสั้น อะซิโตไนไตร์ล เฮปเทน และเดคเคนที่มีความเข้มข้นสูงถึงร้อยละ 75 (ปริมาตรต่อปริมาตร) อีกด้วย แอคติวิตีของเอนไซม์ไลเปสถูกยับยั้งอย่างสมบูรณ์ในสภาวะที่มี Fe²⁺, Mn²⁺, EDTA, SDS และไทรทอล X-100 ขณะที่ทวีน 80 ส่งผลยับยั้งแอคติวิตีของเอนไซม์อย่างมาก เช่นกัน แต่การเติม PMSF, Na⁺ และ Mg²⁺ สามารถเพิ่มแอคติวิตีของเอนไซม์ได้ ส่วน Ca²⁺ และ Li⁺ ไม่ส่งผลทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของค่าแอคติวิตี Ba²⁺, Ag⁺, Hg⁺, Ni²⁺, Zn²⁺ และ DTT ยับยั้ง แอคติวิตีของ เอนไซม์ลงครึ่งหนึ่ง เอนไซม์ไลเปสจาก A. baylyi สามารถไฮโดรไลซ์สับสเตรทพาราไนโตรฟีนิลเอสเทอร์ได้หลายชนิดแต่ชอบที่จะไฮโดรไลซ์สับสเตรทที่มีความยาวของสายเอซิลปานกลางระหว่าง C8 ถึง C12 รวมทั้งสามารถเร่งปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสสับสเตรทที่เป็นน้ำมันและไขมันธรรมชาติหลายชนิด ซึ่งชอบที่จะไฮโดรไลซ์น้ำมันรำข้าว น้ำมันข้าวโพด น้ำมันงา และน้ำ มันมะพร้าว มากกว่าน้ำ มันปาล์มถึง 11 เท่า เมื่อนำ เอนไซม์ไลเปสมาเร่งปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่นของน้ำมันปาล์มเป็นเมทิลเอสเทอร์ของกรดไขมัน พบร้อยละการเปลี่ยนที่ 31.64 ± 1.58 ภายในเวลาในการเร่งปฏิกิริยา 48 ชั่วโมง

แบคทีเรียไอโซเลทที่ 2 ที่จัดจำแนกสายพันธุ์เป็น Aeromonas sp. EBB-1 สามารถผลิตเอนไซม์ไลเปส ปริมาณสูงเมื่อทำการเลี้ยงในอาหารที่มีน้ำมันมะกอก ความเข้มข้นร้อยละ 0.5 (ปริมาตรต่อปริมาตร) เป็นเวลา 15 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส และค่าพีเอชเท่ากับ 8.0 และเอนไซม์ไลเปสจะมีปริมาณการผลิตสูงที่สุดในอาหารเลี้ยงที่มียีสต์เอ็กแทรกซ์ความเข้มข้นร้อยละ 2.5 (น้ำหนักต่อปริมาตร) นอกจากนี้การเติมกลูโคสความเข้มข้นร้อยละ 0.1 (น้ำหนักต่อปริมาตร) โพรลีน ความเข้มข้นร้อยละ 1.5 (น้ำหนักต่อปริมาตร) และกัมอะราบิกความเข้มข้นร้อยละ 0.5 (น้ำหนักต่อปริมาตร) ลงในอาหารเลี้ยงสามารถเพิ่มแอคติวิตีของเอนไซม์ไลเปสได้ ประมาณ 9, 10 และ 6 เท่า ตามลำดับ แต่เมื่อเสริมแหล่งอาหารต่างๆร่วมกันในอาหารเลี้ยงจะส่งผลยับยั้งการผลิตเอนไซม์ เมื่อทำบริสุทธิ์เอนไซม์ด้วย การตกตะกอนเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตความเข้มข้นเกลืออิ่มตัวร้อยละ 40-50 และผ่านคอลัมน์โครมาโทกราฟีแบบคัดกรองขนาดและการทำอัลตร้าฟิลเตชั่น พบเอนไซม์ไลเปสขนาดมวลโมเลกุลสัมพัทธ์ประมาณ 45 กิโลดาลตัน ที่มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 30 เท่า การทดสอบปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสสับสเตรท pNPP ให้ค่าแอคติวิตีสูงที่สุดที่ค่าพีเอชเท่ากับ 8.0 และที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และเอนไซม์ยังคงรักษาความเสถียร ได้ที่ค่าพีเอช 6.0-8.0 และที่อุณหภูมิ 30-80 องศาเซลเซียส แอคติวิตีของเอนไซม์จะลดลงเล็กน้อยเมื่ออยู่ในสภาวะที่มีไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ล เดคเคน หรือเฮปเทน ที่ความเข้มข้นร้อยละ 50 (ปริมาตรต่อปริมาตร) และมีค่าแอคติวิตีเหลืออยู่ครึ่งหนึ่งในสภาวะที่มีบิวทานอลและเบนซีน ขณะที่ DMSO เมทานอล เอทานอล และเฮกซาเดคเคน ส่งผลยับยั้งค่าแอคติวิตีของเอนไซม์ร้อยละ 60 นอกจากนี้ยังพบว่าเกลือ ไอออนเกือบทุกชนิด ยกเว้น Ca²⁺ และ ทวีน 80, DTT, PMSF, SDS, และ EDTA ส่งผลยับยั้งค่าแอคติวิตีของเอนไซม์และเอนไซม์ชอบที่จะไฮโดรไลซ์สับสเตรทพาราไนโตรฟีนิลเอสเทอร์ที่มีสายเอซิลยาว ระหว่าง C12 และ C16

เมื่อทำการแยกยีนที่กำหนดการสร้างเอนไซม์ไลเปสของ A. baylyi ออกจากโครโมโซมอลดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคพีซีอาร์ พบยีนมีขนาด ORF เท่ากับ 972 คู่เบส ที่สามารถแปลเป็นกรดอะมิโนจำนวน 323 เรซิดิว ที่มีความเหมือนสูงสุดเท่ากับร้อยละ 79 กับยีนไลเปสของ Acinetobacter sp. ADP1 เมื่อทำการโคลนยีนและแสดงออกในดีเอ็นเอพาหะเอื้อการแสดงออก pColdI พบว่าริคอมบิแนนท์ไลเปสที่แสดงออกใน Escherichia coli มีการแสดงออกมากเกินไปจนจับกันเป็นก้อนตะกอนอยู่ภายในเซลล์ในรูปของอินคลูชั่นบอดี้ เมื่อศึกษาสภาวะทางกายภาพที่ส่งผลต่อ การแสดงออกพบว่า สภาวะที่เหมาะสมในการแสดงออกริคอมบิแนนท์ไลเปสคือ การใช้เชื้อเจริญก่อนการเหนี่ยวนำการแสดงออกที่มีค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 600 นาโนเมตรอยู่ในช่วง 0.5-0.7 และเหนี่ยวนำการแสดงออกด้วย IPTG ความเข้มข้น 250 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 30 นาที ที่อุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียส เมื่อแสดงออกริคอมบิแนนท์ไลเปสร่วมกับโปรตีนชาร์เพโรน GroEL ในสภาวะเหมาะสมที่หาได้พบว่า สามารถลดการเกิดอินคลูชั่นบอดี้ได้บางส่วน โดยสามารถวัดกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสที่เร่งปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสสับสเตรท pNPP ได้ 0.42 หน่วยเอนไซม์ต่อมิลลิลิตร ในส่วนใสที่ปราศจากเซลล์ แต่แอคติวิตีของริคอมบิแนนท์ไลเปสที่ได้ยังมีปริมาณต่ำกว่าที่ได้จาก A.baylyi อยู่มาก

เมื่อทำการตรึงเซลล์ของ A. baylyi ด้วยวิธีการดักเก็บในเม็ดเจลพบว่าเม็ดเซลล์ตรึงไม่มีความเสถียรเมื่อนำมาใช้เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่น น้ำมันปาล์ม จึงสนใจที่จะตรึงเอนไซม์ไลเปสของ A. baylyi แทน การทดลองตรึงเอนไซม์ไลเปสบนตัวค้ำจุนประเภทไฮโดรโฟบิก 4 ชนิด และพบว่าตัวค้ำจุน Sepabead ECOD เป็นตัวค้ำจุนที่เหมาะท ี่จะนำมาใช้ในการตรึงเอนไซม์ไลเปสจาก A. baylyi มากที่สุด เมื่อหาสภาวะที่เหมาะสม ในการตรึงเอนไซม์ไลเปสทนตัวทำละลายอินทรีย์จาก A. baylyi บนตัวค้ำจุน Sepabead EC-OD พบสภาวะที่เหมาะสมคือ การตรึงเอนไซม์ในบัฟเฟอร์ที่มีค่าพีเอชเท่ากับ 7.0 และมีความเข้มข้น 30 มิลลิโมลาร์ ใช้ปริมาณโปรตีนของเอนไซม์ไลเปสเท่ากับ 7 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 120 นาที และใช้เมทานอลความเข้มข้นร้อยละ 10 (ปริมาตรต่อปริมาตร) เป็นสารสนับสนุน การศึกษาคุณลักษณะเฉพาะของเอนไซม์ไลเปสตรึงรูปที่เตรียมได้พบว่าเอนไซม์สามารถเร่งปฏิกิริยา ไฮโดรไลซิสสับสเตรท pNPP ได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียสและค่าพีเอชเท่ากับ 9.0 โดยยังคงมีความเสถียรที่ค่าพีเอช 8.0-9.0 และที่อุณหภูมิ 50-80 องศาเซลเซียส แอคติวิตีของเอนไซม์ลดลงเล็กน้อย ในสภาวะที่มีไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ลและเฮปเทนที่ความเข้มข้นร้อยละ 50 (ปริมาตรต่อปริมาตร) และมีแอคติวิตีลดลงน้อยกว่าร้อยละ 34 ในสภาวะที่มีเฮกซาเดคเคนและแอลกอฮอล์ลสายสั้น แต่เบนซีนไม่ส่งผลต่อแอคติวิตีของเอนไซม์ ซึ่งให้ผลที่สอดคล้องกับคุณลักษณะเฉพาะของเอนไซม์ไลเปสบริสุทธิ์ของ A. baylyi เมื่อทดลองใช้เอนไซม์ไลเปสตรึงรูปที่เตรียมได้เร่งปฏิกิริยา ทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่นของน้ำมันปาล์มพบว่า สภาวะที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาคือ การเติมเมทานอลลงในปฏิกิริยา 6 ครั้ง โดยใช้อัตราส่วนเมทานอลต่อน้ำมันปาล์มเท่ากับ 4 ต่อ 1 และใช้ปริมาณ เอนไซม์ไลเปสตรึงรูปร้อยละ 20 น้ำหนักเอนไซม์ตรึงรูปต่อน้ำหนักน้ำมัน ทำปฏิกิริยาในสภาวะที่มีน้ำร้อยละ 4 (ปริมาตรต่อน้ำหนักน้ำมัน) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส และเมื่อนำเอนไซม์ไลเปสตรึงรูปที่เตรียมได้มาทดสอบการใช้ซ้ำเทียบกับเอนไซม์ไลเปสตรึงรูปที่มีขายทางการค้า 2 ชนิด คือ Novozyme 435 และ Lipozyme RM IM พบว่า เอนไซม์ไลเปสตรึงรูปที่เตรียมได้จะสูญเสียแอคติวิตีเมื่อใช้ซ้ำในครั้งที่ 2 และ 3 และจะไม่สามารถทำงานได้อีกเมื่อใช้ซ้ำในครั้งที่ 5 ผลการทดลองที่ได้ใกล้เคียงกับการใช้เอนไซม์ไลเปสตรึงรูป Lipozyme RM IM และ Novozyme 435 แต่มีข้อได้เปรียบที่เหนือกว่าการใช้เอนไซม์ไลเปสตรึงรูปทางการค้าตรงที่สามารถเร่งปฏิกิริยาได้และผลิตไบโอดีเซลได้สูงขึ้นเมื่อมีน้ำปนเปื้อนในปฏิกิริยา ซึ่งเป็นปัญหาที่พบบ่อยในการผลิตไบโอดีเซลในระดับอุตสาหกรรม ผลการทดลองที่ได้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพของเอนไซม์ไลเปสตรึงรูปจาก A. baylyi ในการนำมาใช้เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพ ของอุตสาหกรรมการผลิตพลังงานชีวภาพหรือแม้กระทั่งใช้ในอุตสาหกรรมการสังเคราะห์สารอินทรีย์หรือทางเภสัชกรรมต่อไป

แหล่งข้อมูล:

• โครงการวิจัยชื่อ “การเปรียบเทียบประสิทธิภาพในการผลิตไบโอดีเซลจากน้ำมันปาล์มโดยปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่นระหว่างเซลล์ตรึงแบคทีเรียและเอนไซม์ไลเปสตรึงรูปที่ทนต่อตัวทำละลายอินทรีย์”” – ระยะเวลาโครงการ: มกราคม 2553 – กรกฎาคม 2555